SARS の UV222 消毒

Scientific Reports volume 12、記事番号: 14545 (2022) この記事を引用

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新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の原因となる SARS-CoV-2 の感染を減らすためには、証拠に基づいた工学的制御が緊急に必要とされています。 紫外線（UV）光はコロナウイルスを不活化することが知られていますが、従来のUVランプには有毒な水銀が含まれており、222nm（UV222）を放射するクリプトン塩素エキシマランプよりも人体にとってより危険な波長（254nm）を放射します。 ここでは、培養アッセイと分子アッセイを使用して、UV222 に曝露された SARS-CoV-2 溶液の最初の用量反応を提供しました。 培養アッセイ（Vero 宿主に対するプラーク感染力）では、8 mJ/cm2 の UV222 線量（擬似一次速度定数 = 0.64 cm2/mJ）後の SARS-CoV-2 の 99.99% 以上の消毒が実証されました。 UV222 処理直後、ヌクレオカプシド (N) 遺伝子を標的とした RT-qPCR アッセイでは、N 遺伝子損傷が消毒動態に約 10% 寄与していることが示され、N タンパク質を標的とした ELISA アッセイでは、N タンパク質損傷が消毒動態に寄与していないことが示されました。 分子的結果は、他の遺伝子およびタンパク質の損傷が消毒にさらに寄与していることを示唆しています。 宿主細胞との 3 日間のインキュベーション後、UV222 処理した SARS-CoV-2 の RT-qPCR および ELISA 動態は培養動態と同様であり、培養なしで UV 消毒を測定する分子アッセイの使用の妥当性が示唆されました。 これらのデータは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の感染を防ぐための UV222 の実施に役立つ定量的な消毒動態を提供します。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、最近出現した治療法のない感染症であるコロナウイルス病 2019 (COVID-19) の病原体です。 SARS-CoV-2 は、感染者がさまざまなサイズの粒子として放出した浮遊ウイルスに粘膜 (例、肺、目) がさらされると、主に人から人へ広がります 1、2。 感染は、複数の人々に影響を与えるさまざまな疾患経過をもたらします。臓器系（呼吸器、心臓、神経、胃腸）。 このため、新型コロナウイルス感染症の症状は多様であり、無症候性感染、発熱、咳、呼吸困難、倦怠感、吐き気、味覚障害/嗅覚障害、せん妄、死亡などが含まれます。 多くの抗ウイルス療法および宿主指向性療法が、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の治療法として研究されているか、研究されています 3-15。 これらの治療法とワクチンは、現在までに 200 万人近くが死亡している現在の新型コロナウイルス感染症のパンデミックにおいて楽観的な見方をする原因となっています。 しかし、ワクチンが広く利用可能になった後でも、この感染症やその他の新興感染症に対しては、社会的距離の確保、フェイスマスクを含む個人用保護具（PPE）、感染を制限するその他の工学的ソリューションが今後も必要とされ続けるでしょう3。 最近、SARS-CoV-2 Spike タンパク質に対する PPE の人工表面化学が研究されています4。

紫外線 (UV) 照射は、ヒトコロナウイルス OC43 (風邪の原因となる HCoV-OC43 5) や SARS-CoV (2002 年の SARS 流行の病原体 6-8) など、多くの呼吸器系ウイルスを不活化する効果的な手段です。 UV は一般に、室内上部の空気消毒、HVAC システム、自立型空気清浄機や表面清浄機に適用されます。 しかし、SARS-CoV-2 の感染を最小限に抑えるために、広く証拠に基づいたレベルで UV を使用することの実現可能性は、現在、次の 2 つの理由によって制限されています。(1) 従来の水銀ベースの低圧 UV ランプは、多くの環境で実用的ではありません。人間の健康（254 nmの波長放射は皮膚がん9や白内障10を引き起こす）と環境（壊れやすい石英ランプの電球が割れることで生じる水銀は有毒11）に有害であり、（2）SARS-CoV-2を不活化するために必要なUV線量反応動態は不明である。 。 これら 2 つの課題が克服されれば、感染の可能性が高い環境 (例: 集団介護施設、回復期患者の自宅、病院の待合室、飛行機の客室) で SARS-CoV-2 を不活化するための UV の使用は、実用的で容易に導入できる工学となるでしょう。現在の予防策（社会的距離、フェイスマスク、ワクチン）を強化する解決策。 さまざまな公共の場で UV への関心と応用が高まっているため、UV による目や皮膚へのリスクのバランスをとる工学設計の決定に情報を提供するために、UV 放射線に対する SARS-CoV-2 の用量反応動態を理解することが緊急に必要となっています。ウイルス伝播による感染のリスクを伴う暴露。

今回我々は、240 nmを超えるより有害な波長の透過を低減するためにフィルター処理されたクリプトン塩素（KrCl）エキシマランプ（エキシランプ）から発せられる主に222 nmのUV光に曝露した後の、液体中のSARS-CoV-2の用量反応動態を実証する。 より低い波長の発光 (222 nm) は、人間の皮膚モデルや齧歯動物において発がん性がなく 12、齧歯動物において急性角膜損傷を引き起こすこともありません 13。 さらに、KrCl エキシランプによって放射される 222 nm の波長は、より低い波長でターゲット生体分子の吸光度が大きいため、低圧水銀ランプによって放射される 254 nm よりも消毒 14、核酸損傷 15、タンパク質損傷 16、17 に対して本質的に効果的です。 KrCl エキシランプに含まれるクリプトンと塩素は水銀よりもはるかに毒性が低く、KrCl エキシランプは、長年にわたる製品開発と最適化を経た水銀ランプと電気効率の点で競争力があることがすでに示されています 18。 標準的な培養ベースのアッセイで必要とされるウイルス増殖を必要とせずに用量反応をより安全に定量化するために、市販のアッセイを使用して UV222 処理後にヌクレオカプシドタンパク質と N 遺伝子への損傷を測定しました。 我々の結果は、病原性SARS-CoV-2の水溶液がKr-Clエキシランプから発せられるUV222光に曝露されると、その感染力と完全性がUV用量依存的に減衰することを、培養アッセイおよび分子アッセイで測定したところ実証している。 これらの最初の UV222 消毒用量反応は、SARS-CoV-2 を不活化するアプローチとしての UV の実現可能性を示しています。

SARS-CoV-2、分離株 USA-WA1/2020 は、バイオディフェンスおよび新興感染症研究リソース リポジトリ (BEI リソース、バッチ番号 70034262) から取得され、オハイオ州立大学バイオセーフティ レベル 3 研究室 (IBC プロトコル # 2020R00000046) で保存および培養されました。 。 この研究で使用したウイルスストックは、バッチを解凍し、不完全 DMEM (Gibco Cat# 11995-065、4.5 g/L d-グルコース、110 mg/L ピルビン酸ナトリウムを補充) で 1:10,000 に希釈し、これをコンフルエントなベロ細胞（ATCC クローン E6）の T175 フラスコに移し、1 時間インキュベート（37 °C、5% CO2）した後、上清を除去し、完全 DMEM（cDMEM; 上記の DMEM に 4% の熱を加えたもの）と置き換えます。 -不活化ウシ胎児血清）。 これらの T175 フラスコを 3 日間 (37 °C、5% CO2) 培養して、感染性ウイルスを増殖させました。 この期間の終わりに、光学顕微鏡によるフラスコの目視検査により、ほぼすべてのベロ細胞が死滅していることが証明された。 各 T175 フラスコの上清は、この時点で感染性ウイルスが含まれていると推定され、慎重に移して 50 mL の円錐形に合わせ、低速で遠心分離して細胞破片を除去し、微量遠心分離管に等分し、凍結して -80°で保存しました。 C. 凍結アリコート中の生ウイルス力価は、Diamond Laboratory 19 によって開発され、以下に説明する改良版のプラークアッセイを使用して、1 mL あたり約 107 プラーク形成単位 (PFU) であると測定されました。

UV222 光源 (USHIO Care222®) は、240 nm を超える発光を低減するために光学的にフィルター処理された KrCl エキシランプです。 放射照度またはスペクトルの測定または照射の前に、UV 源をオンにして 15 分間ウォームアップしました。 準平行ビーム消毒研究 20 を実施し、多色 UV 線量を計算する 21 ために、標準化された手順に従いました。 UV222 光源の発光スペクトルは、極度のソラリゼーション耐性 455 µ ファイバーと Spectralon 拡散コサイン補正器検出器を備えた、NIST トレーサブルで校正された Ocean Optics HDX UV-Vis 分光放射計を使用して測定されました。 OceanViewソフトウェアからの生のスペクトルデータは、Microsoft ExcelのFORECAST関数を使用して整数の波長に補間され、線量計算に使用するために222 nmのピーク発光に相対化されました（図1および補足図S1）。 総入射 UV-C 放射照度は、SED 220/U ソーラー ブラインド検出器、コサイン補正用の W Quartz ワイド アイ ディフューザー、およびピーク放射照度応答 NIST トレーサブル キャリブレーションを備えた International Light Technologies (ILT) 2400 放射計を使用して測定されました。 放射照度測定の場合、ピーク波長校正値が放射計係数として手動で入力されました。 入射放射照度は、UV 露光中にサンプル表面の高さと位置を中心とした放射計の検出面で測定され、いくつかの要因で補正されてサンプル深さ全体の平均放射照度が決定されました。 放射の空間的不均一性は、ペトリ皿の中心から端まで0.5cm刻みで放射照度を測定することによって各テストで考慮され、相対化されてペトリ係数が決定されました。ペトリ係数は常に> 0.9でした。 典型的な検出器のスペクトル応答は ILT から取得され、ランプ発光に対して積分された放射計係数 (0.9971) を計算するために使用されました。 以前と同様に 22、222 nm のピーク波長における水の反射率は 0.9726 と仮定されました。 発散係数は、ランプとサンプル表面の間の距離、およびサンプルの深さを考慮して実験日ご​​とに決定され、常に > 0.9 でした。 水分係数は、入射放射照度と、波長固有の吸収後のサンプルの深さにわたって積分された平均放射照度との間の比率によって、サンプルごとに決定されました。 ウイルス作業ストック（各試験用に新たに調製）の紫外可視吸光度は、バイオセーフティキャビネット内で Nanodrop™ OneC 分光光度計を使用し、波長 200 ～ 295 nm の場合は微量ペデスタルを使用し、195 nm を超える波長の場合は 1 cm 石英キュベットを介して測定しました。 各試験の作業ストックの吸光度スペクトルを図1および2に示します。 1とS1。 サンプル中心の入射放射照度を調整した後、平均放射照度を使用して、事前に決定した UV 線量 (0 ～ 40 mJ/cm2) の露光時間 (最大: 15 分、最小: 15 秒) を計算しました。 3 つの消毒テストは、最大 2.7 mJ/cm2 の UV 線量の場合は最大 115 秒、最大 40 mJ/cm2 の UV 線量の場合は最大 856 秒、最大 30 mJ/cm2 の UV 線量の場合は最大 1260 秒の曝露時間で実行されました。 、 それぞれ。 (補足表S1にまとめられています)。

(A) フィルター処理された KrCl エキシランプ (USHIO Care222®) の 200 ～ 300 nm の生のスペクトル発光を補間し、UV 線量の計算に使用するために 222 nm のピーク発光に相対化しました。 (B) UV 線量の計算に使用する 3 つの生物学的に独立したテストのそれぞれについて、cDMEM 中の約 105 PFU/mL での SARS-CoV-2 の 200 ～ 300 nm の吸光度スペクトルを測定しました。 200から800 nmまでの拡張された発光スペクトルと吸光スペクトルを補足図S1に示します。

すべての UV 測定、サンプル前処理、UV 処理、およびその後の処理済みサンプルの取り扱いは、バイオセーフティキャビネット内で実行されました。 3 つの生物学的に独立したテストの当日、UV 源が暖まり、線量計算のために測定が行われる間に、SARS-CoV-2 のアリコート (事前に 107 PFU/mL で力価測定) が cDMEM で希釈され、「作業ストック溶液」が作成されました。 」 目標力価は 105 PFU/mL です。 試験した各 UV 線量について、滅菌テフロンコーティングされたマイクロスターバー (VWR カタログ # 58948) を備えた 3 mL の作業ストック溶液を、面積 3.7 cm2、直径 3.5 cm のポリスチレン組織培養皿 (VWR カタログ # 82050-538) にピペットで移しました。 -353) を小さな撹拌プレート上の UV 光の下に置き、シャッターで UV 光を遮断しながら静止混合を達成します。 組織培養皿の蓋を取り外した後、シャッターを取り外し、所定の UV 線量に対応する計算された露光時間サンプルを UV 光に曝露した後、アパーチャを交換して UV 曝露を終了しました。 その直後に、処理した培地を滅菌 15 mL ポリプロピレン遠心管 (VWR) に移し、以下に記載するアッセイに使用しました。 未処理のサンプルの作業ストックを、遠心分離管 (0 mJ/cm2) に移す前に、ランプをオフにして代表的な時間撹拌プレート上に置きました。

プラークアッセイを使用して、UV 処理前 (0 mJ/cm2) および UV 処理後 (他のすべての UV 線量) のサンプルの PFU/mL を決定しました。 この研究に使用されたプラークアッセイは、Case et al.19 によって最初に開発および報告されたものの改良版であり、ここではステップ 1 ～ 5 としてリストされています。 (ステップ 1) アッセイの少なくとも 18 時間前に、アッセイ開始までに各ウェルがコンフルエントになるように、12 ウェル プレートに十分な数の Vero 細胞を播種しました。 プレートを37℃で一晩インキュベートした。 (ステップ 2) アッセイ当日 (0 日目)、ウイルス含有培地 (UV 処理ウイルスサンプルなど) の段階希釈物を cDMEM で調製しました (1:101、1:102、1:103、1:104)。そして37℃に温めました。 （ステップ３）１２ウェルプレートの各ウェルから培地をピペットで静かに除去し、５００μＬの各ウイルス段階希釈液と置き換え、ベロ細胞単層を乱さないようにウェルの側面にピペットで滴下した。 (ステップ 4) プレートを 37 °C、5% CO2 で 1 時間インキュベートしました。 (ステップ 5) その感染インキュベーション期間中に、cDMEM と 2% メチルセルロースの 1:0.7 混合物 (粘度: 4000 cP) を含む溶液を新たに作成し、ウォーターバスで 37 °C に温めました。 1 時間の感染インキュベーション期間の後、上清を各ウェルから除去し、1 mL の温めた cDMEM/メチルセルロース混合物と置き換えました。 （ＳＴＥＰ６）その後、培養プレートをインキュベーターに戻し、３日間静置した。 最終日 (3 日目) に、cDMEM/メチルセルロース混合物を各ウェルから除去し、細胞を PBS 中の 4% パラホルムアルデヒドで固定し (20 分間、室温)、PBS で洗浄し、0.05% クリスタル バイオレット (溶液中で) で染色しました。 20% メタノール)。 プレートを蒸留水ですすいだ後、プレートを乾燥させ、倍率20倍の光学顕微鏡下でプラークを計数した。

この研究に使用したウイルス増殖アッセイは、STEP 4 の後、ウイルスを含む培地を (cDMEM/メチルセルロース混合物の代わりに) 1 mL の温 cDMEM に置き換えたことを除いて、上記のプラークアッセイと同じです。 その後、培養プレートをインキュベーターに戻し、３日間静置した。 最終日に、各ウェルの細胞上清を収集し、微量遠心分離管に移し、低速で遠心分離して細胞破片を除去し（1000×g、10分間）、微量遠心分離管に等分し、凍結して-80℃で保存した。 。 その後、アリコートを SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド (N) 遺伝子コピーの定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) 測定、および SARS-CoV-2 N タンパク質濃度の ELISA 測定に使用しました。

定量的 PCR (qPCR) を使用して、UV 処理前 (0 mJ/cm2) および UV 処理後 (他のすべての UV 線量) (「0 日目」サンプル) のサンプルの RNA 抽出物中の SARS-CoV-2 N 遺伝子を直接定量しました。および増殖アッセイからの細胞上清アリコートの RNA 抽出物 (「3 日目」サンプル)。 QIAamp Viral RNA 法 (Qiagen) を使用してサンプルから RNA を抽出し、ランダム ヘキサマー プライマーを使用した SuperScript IV 第一鎖合成法 (Invitrogen) を使用して cDNA に変換しました。 続いて、疾病管理センターによって独自に開発された「N1 プライマー セット」および関連する PCR 条件を使用して cDNA を増幅しました23。 これらのプライマーは、N 遺伝子 (NCBI Ref Seq NC_045512.2) のヌクレオチド 13 ～ 85 に特異的で、短い (72 nt) アンプリコンを生成します。 2019-nCoV_N1-R (リバース) プライマー、5'-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3'。 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)、上記の N1 フォワード/リバース プライマー (最終濃度: 500 nM)、および蛍光標識 N1 TaqMan プローブを含む定量 PCR (q-PCR) アッセイで cDNA を PCR 増幅しました。 (5'-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3'; 最終濃度 125 nM)。 q-PCR アッセイを BioRad CFX Connect リアルタイム PCR システムで実行し、サンプルと標準から CT 値を決定しました。 N遺伝子コピー数とCT値を関連付けるcDNAに変換されたインビトロ転写RNAの各プレートで段階希釈を実行することにより、N1プライマーセットの標準曲線を作成しました。 この標準を生成するために、SARS-CoV-2 ストックのアリコートから RNA を抽出し、上記の N1 プライマーセットを使用して N 遺伝子を増幅する前に cDNA に変換しました。 アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によって視覚化し、ゲルを抽出し、T7プロモーターの下流のプラスミドベクターpCR II-TOPO (Invitrogen)にクローニング/連結した。 ライゲーション産物を大腸菌に形質転換し、ランダムに選択したコロニーのミニプレップを PCR によってインサートの存在についてスクリーニングしました。 次に、単一クローンを使用して、HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 法 (New England Biolabs) を使用して、正確な遺伝子コピー数測定に必要な試薬である in vitro 転写 (IVT) N 遺伝子 RNA を生成しました。 IVT RNA を DNase で処理し、クリーンアップ反応を実行した後、Nanodrop を介して RNA 濃度を測定しました。 μL あたりの一本鎖 N 遺伝子 RNA 転写物のコピー数は、次の方程式によって決定されました: [RNA 濃度 (Nanodrop 測定、ng/μL) × アボガドロ数 (6.02 × 1023)] / [転写物の予測分子量 (23 kDa) ×109]。 IVT RNA の段階希釈を行い (範囲: 1013 ⟶10–1 コピー/μL)、上記のように cDNA に変換し、上記の N 遺伝子コピー数アッセイの標準として使用しました。

qPCR を使用して、UV 処理前 (0 mJ/cm2) および UV 処理直後 (他のすべての UV 線量) (「0 日目」サンプル) の作業ストックのサンプルの RNA 抽出物中の SARS-CoV-2 N 遺伝子を定量しました。 RNA をサンプルから抽出し、上記のように cDNA に変換しました。 続いて、CDC 2019 N1 プライマー セットと N2 プライマー セットの組み合わせを使用して cDNA を定量し、長い (944 nt) アンプリコンを生成しました。 2019-nCoV_N2-R (リバース) プライマー、5'-GCGCGACATTCCGAAGAA-3'。 プライマーは IDT から入手し、10 mL SsoFast EvaGreen Supermix (BIO-RAD)、7.75 mL ヌクレアーゼフリー水 (Fisher Scientific)、および 2 mL cDNA テンプレート中の最終濃度は 500 nM でした。 総量 20 mL の反応を、Applied Biosystems QuantStudio 7 リアルタイム PCR システムで少なくとも技術的に繰り返し実行し、サンプルおよび標準から CT 値を決定しました。 N1-2 プライマー セットの場合、標準は完全な N 遺伝子の二本鎖 DNA コントロール プラスミド (2019-nCoV_N_Positive Control、IDT) の段階希釈で構成されています。

UV 処理前 (0 mJ/cm2) および UV 処理後 (他のすべての UV 線量) (「0 日目」サンプル)、および増殖アッセイからの細胞上清アリコート (「3 日目」サンプル) 中の N タンパク質の濃度を測定しました。 SARS-CoV-2 抗原定量アッセイキット (ELISA) 法 (ADS Biotec) を使用します。 メーカー提供のキャリブレーションコントロールを使用して、N タンパク質濃度とサンプル吸光度 (波長: 450 nm) に関係する標準曲線を作成しました。 標準曲線の外側の値はさらに希釈され、必要に応じて再実行されました。 SARS-CoV-2 の陽性シグナルは、0 日目の未処理ウイルスサンプルでは 2.7 × 105 ± 9.8 × 104 pg/mL、3 日目の未処理ウイルスサンプルとインキュベートした細胞培養上清では 1.4 × 108 ± 3.0 × 108 pg/mL でした。ウイルスサンプルなしでインキュベートしたネガティブコントロール細胞培養上清では、Nタンパク質は検出されませんでした。

グラフは、GraphPad Prism または Microsoft Excel プログラムを使用して作成されました。 統計分析 (回帰係数の標準誤差を決定するデータ分析アドインを使用した回帰を含む) は、これらのプログラムにバンドルされているソフトウェアを使用して実行されました。 Log10 減少 (LR) は log10(No/N) として計算されました。ここで N は、プラーク アッセイではウイルス PFU/mL、短い N1 アンプリコンまたは長い N1-2 アンプリコンのいずれかの qPCR アッセイでは N 遺伝子コピー/μL、または所定の UV222 線量に曝露した後の ELISA アッセイにおける N タンパク質濃度 (pg/mL)。No は初期濃度でした。 この研究における再現レベルは、生物学的に独立した 3 つのテストであり、各アッセイについて少なくとも技術的に重複したものでした。 すべての培養および分子アッセイの生物学的および技術的複製の概要を表 S2 に示します。

ウイルス感染力 UV222 の用量反応は、指数関数的減衰速度論によって特徴付けられました (図 2)。 実験2の代表的なプラークアッセイ結果を補足図S2に示します。 平均初期ウイルス力価 6.51 × 104 PFU/mL では、ウイルス消毒の疑似一次速度定数は - 1.48 cm2/mJ (R2 = 0.89) でした。 所定の UV 線量に曝露後のウイルス感染力の log10 減少 (LR) として表すと、線形速度定数は 0.64 cm2/mJ (R2 = 0.95) で、これは D90 (1 log10 または 90% 不活化のための線量) に相当します。 1.6mJ/cm2。 用量範囲と初期ベロ細胞集密度は、テスト 3 の反復実験において用量反応を定量化するのにのみ十分でした。 ただし、テスト 2 では、未処理サンプルの平均初期ウイルス力価 3.54 × 104 PFU/mL は、少なくとも 4.25 log の LR に相当する 10 mJ/cm2 の最初の試験用量で検出未満に減少しました。 これらの結果は、テスト 1 の定性的結果とも一致しており、未処理サンプルではベロ細胞がほとんど死んでいるように見え、線量 0.7 および 1.4 mJ/cm2 を通じて徐々に健康に見え、2 mJ/cm2 を超える線量では健康に見えました。

(A) サンプルを各 UV222 用量に曝露した 3 日後にプラークアッセイによって測定された SARS-CoV-2 力価 (黒丸) は、平均初期 (0 mJ/cm2) ウイルス力価 6.51 × 104 PFU から始まる指数関数モデルに当てはめられました。 /mL から最大 8 mJ/cm2 までの応答で、PFU/mL が最初にアッセイ検出限界 (DL) の 2 PFU/mL (白丸) を下回りました。 エラーバーは、少なくとも 2 つの技術的反復の標準偏差を表します。 (B) 各 UV222 線量への曝露後のウイルス力価の SARS-CoV-2 log10 減少 (LR) (黒丸) は (A) から計算され、応答アップを通じて 0 mJ/cm2 で原点を通過する線形モデルに当てはめられました。 LR が最初に 4.51 log の DL を超えた 8 mJ/cm2 (白丸) まで。 実験2の代表的なプラークアッセイ結果を補足図S2に示します。

すべてのテストを通じて、N1 アッセイにおける SARS-CoV-2 の検出は、未処理ウイルスに感染した細胞培養物 (0 mJ/cm2) では 10.66 ± 0.27 log10 コピー/μL、未感染の細胞培養上清では 5.06 ± 0.78 log10 コピー/μL でした。 RNA抽出ネガティブコントロールでは5.49 log10コピー/μL、テンプレートなしRT-qPCR反応コントロールでは3.66±0.23 log10コピー/μL（濃度データと標準曲線は補足図S3およびS5に示されています）。 RNA 抽出ネガティブ コントロール (表 S3 にリストされている CT 値) での増幅のため、サンプル、コントロール サンプル、および標準曲線の RNA 抽出ネガティブ コントロールの CT 値より大きい CT 値を持つポイントを除外しました。 この背景にもかかわらず、バックグラウンドは LR 計算によって打ち消されるため、線量反応は依然として識別可能でした。 さらに、3 日目の増殖アッセイ データは、未処理ウイルス (0 mJ/cm2) に感染した細胞培養物でほぼ 3 log10 コピー/μL のシグナル増加を示し、0 日目の 9.7 ～ 9.9 log10 コピー/μL から 12 ～ 12.6 log10 コピー/μL の範囲でした。これにより、感染性ウイルスの増殖による初期濃度の低下を検出する能力が向上し、その結果、LR の検出限界が低下して、UV 線量反応のより適切な推定が可能になります。

N 遺伝子の N1 領域にわたる短いアンプリコン (CDC 2019) の場合、治療直後 (「0 日目」) の UV222 に応答したウイルス RNA 損傷も、指数関数的減衰速度論によって特徴付けられました (図 3A)。 所定の UV 線量に曝露した後の qPCR 反応における N1 コピー/μL の LR として表すと、線形速度定数は 0.049 ± 0.005 cm2/mJ (傾き ± 標準誤差、R2 = 0.92) でした。 N1 線量応答は、線量応答のテーリングを避けるために 0 ～ 20 mJ/cm2 の線形領域を使用してモデル化されました。 プラークアッセイと同様に最大 10 mJ/cm2 の線量のみを含めた場合、0 日目の N1 遺伝子損傷線量反応の傾き (0.07) は、最大 20 mJ/cm2 の線量 (0.05) よりも高かったが、R2 は同じでした ( 0.92）。 0 ～ 10 mJ/cm2 と 0 ～ 20 mJ/cm2 の線量応答曲線を図 1 と 2 に示します。 S4と3Aは別々です。 プラークアッセイによって測定された SARS-CoV-2 感染性の LR 速度定数と比較して、N1 qPCR によって測定された N 遺伝子損傷の LR 速度定数は約 10 倍低かった。

(A) UV 処理直後 (0 日目) およびサンプルを宿主細胞とインキュベートした後 (3 日目) の SARS-CoV-2 N 遺伝子損傷を、qPCR 反応における N1 (短いアンプリコン) コピー/μL の log10 減少として表します。 (B) UV 処理直後 (0 日目) の SARS-CoV-2 N 遺伝子損傷。qPCR 反応における N1-2 (長いアンプリコン) コピー/μL の log10 減少として表されます。 (C) ELISA によって測定された SARS-CoV-2 N タンパク質濃度は、UV 処理直後 (0 日目) および宿主細胞とサンプルをインキュベートした後 (3 日目) のサンプル中の N タンパク質濃度 (pg/mL) の log10 減少として表されました。 SARS-CoV-2 の N1 アンプリコン、N1-2 アンプリコン、または N タンパク質の UV222 線量に対する log10 減少は、次のように示される 20 mJ/cm2 までの応答を通じて 0 mJ/cm2 で原点を強制的に通過する線形モデルに適合しました。塗りつぶされた円。 モデルに含まれない点は白丸で示します。

図 3A の最大 0 ～ 20 mJ/cm2 の線量に対する増殖アッセイ (「3 日目」) の 3 日後の N1 線量反応では、線形速度定数は 0.230 ± 0.033 cm2/mJ (傾き ± 標準誤差、 R2 = 0.78)。 正の用量反応は明らかであり、傾きはプラークアッセイに近かったが(細胞培養とqPCRを組み合わせた場合、プラークアッセイの用量反応を予測する能力がより優れていることを示している)、細胞培養によって導入された変動の増加により、回帰の強さが減少した。

N 遺伝子の N1 領域と N2 領域の両方にまたがる長いアンプリコン (CDC 2019) では、治療直後 (「0 日目」) の UV222 に応答したウイルス RNA 損傷も指数関数的減衰によって特徴付けられました (図 3B)。 LR 対 UV222 線量の線形速度定数は 0.056 ± 0.005 (傾き ± 標準誤差、R2 = 0.94) でした。 プラークアッセイによって測定された SARS-CoV-2 感染性の LR 速度定数と比較して、N1-2 qPCR によって測定された N 遺伝子損傷の LR 速度定数は約 10 倍低かった。 この類似性は、アンプリコンの長さを増加しても、ウイルス感染力の喪失と相関する遺伝子損傷を検出する能力が増加しなかったことを示しています。 すべての検査において、N1-2 アッセイにおける SARS-CoV-2 の陽性シグナルは、未処理ウイルスに感染した細胞培養物では 4.7 ± 0.1 log10 コピー/μL、未感染の細胞培養上清では検出されず、ウイルス感染細胞培養上清では 0.08 ± 1.4 コピー/μL でした。テンプレートなし RT-qPCR 反応コントロール (濃度データと標準曲線は補足図 S3 および S5 に示されています)。 培養を行わない消毒用量反応の測定改善の可能性を調査するために長いアンプリコンアッセイが使用されたため、3 日目のサンプルは分析されませんでした。

図 3C では、最大 40 mJ/cm2 の線量 (0.002 ± 0.001 cm2/mJ、傾き ± 標準誤差、 R2 = 0.21）、最大 20 mJ/cm2 の用量で 3 日目の細胞培養上清でより強い用量反応が観察されました（0.243 ± 0.028 cm2/mJ、傾き ± 標準誤差、R2 = 0.21）（図 3C）。 すべての検査において、N タンパク質アッセイにおける SARS-CoV-2 の陽性シグナルは、0 日目の未処理ウイルスサンプルでは 2.69 × 105 ± 9.83 × 104 pg/mL、3 日目の細胞培養上清では 1.41 × 108 ± 2.99 × 108 pg/mL でした。未処理のウイルスに感染しており、未感染の細胞培養上清では検出されません（濃度データと標準曲線は補足図S3およびS5に示されています）。

この研究は、水溶液中の SARS-CoV-2 に対する初めての厳密な UV222 用量反応速度論を提供しますが、認識しなければならない限界もあります。 最も重要なことは、この研究は水溶液に懸濁したビリオンを使用して実施されたことです。 これは、このウイルスに最も関連する浮遊ウイルス消毒の用量反応動態を定量化するための出発点にすぎず、温度、湿度、空気流力学、UV リアクターの仕様などの多くの要因が用量反応に影響を与えます。 相対湿度が上昇したときの空気中における感染性病原体の消毒動態と水中における感染性病原体の消毒動態を比較した以前の研究 24-29 では、多くの屋内環境の湿度は感染性病原体の残留を減らすように調整されているため、これらの水量反応は空気中の消毒動態の控えめな推定値を示している可能性があることを示しています。

屋内環境での UV222 の適用に関連するこの研究のもう 1 つの制限は、KrCl エキシランプによって放出される可能性のある真空 UV 波長によるオゾン生成の消毒への影響が測定されていないことですが、バイオセーフティ キャビネット内の高い空気流と、 BSL3施設。 これらのランプによって生成される可能性のあるオゾンによる空気の質への悪影響と建築材料の劣化、240 nm未満の波長による潜在的な健康被害と建築材料のソラリゼーション、および240 nmを超える波長での非ゼロ放射（補足図S1）も考慮する必要があります。新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) やその他の感染症について、UV222 による感染症の伝播を減らすメリットを比較検討する際に考慮されます。

これらの制限を考慮すると、これらのデータは、空気感染ウイルス感染を減らすための UV222 の将来の開発と応用のための強力な基盤となります。 UV222 は人間の暴露に対して少なくとも 4.2 倍安全であり (最近の更新前の人間の UV 暴露の閾値限界値は 222 および 254 nm でそれぞれ 25 mJ/cm2 および 6 mJ/cm2 でした 29)、SARS の消毒においては少なくとも 1.3 倍効果的です。 -CoV-2（UV222（1.6 mJ/cm2）について我々が観察したD90は、Loらによって観察されたUV254（2.15 mJ/cm2）についてのゲノムモデリングによって最近予測された30およびUV254についてのD90（2.5 mJ/cm2）よりも低い） .31）。 他の空気感染コロナウイルスを治療するために、これらの閾値を下回る用量で UV222 を継続的に適用した最近の研究では、数分以内に複数回の不活化が実証されました 32。 SARS-CoV-2 消毒におけるこの低波長の利点は、MS2 バクテリオファージに対して UV222 が UV254 の 2 倍以上効果的であるという研究 22 や、254 nm よりも 222 nm の方が感度が高いことを示す他のウイルス作用スペクトルと一致しています 14,33。 マら。 は、222 nm から 282 nm までのさまざまな波長を使用して、薄膜水溶液中の SARS-CoV-2 の UV 消毒動態を調査し、UV222 が最も優れた性能を示しました 34。 1.42 cm2/mJ という線形定数率は、私たちの研究で報告された値よりも高いです。 これは、彼らのサンプル（0.05 cm-1）と比較して222 nmでのサンプルの吸光度が高いこと、水溶液ではなく薄膜での消毒をテストする異なる実験設定、またはプラークを超える最低線量を含む当社の用量反応モデリングによって説明できる可能性があります。アッセイの検出限界 (図 2)。 最近のレビュー 35 では、UV254 によるコロナウイルス消毒の D90 の中央値は 3.7 mJ/cm2 であると予測されています。 私たちの結果とこれらの予測は、最近検討された SARS-CoV-2 の UV222 および UV254 消毒研究と概ね一致しています 29。 しかし、これらの研究の中には、まだ査読の途中であるものや、実験間の比較や線量の正確な定量化を可能にする標準化された UV 消毒手順が使用されていないものもあります。 現在までに行われた唯一の UV222 SARS-CoV-2 表面除染研究 36 では、研究者らは 0.1 mW/cm2 に 10 秒間曝露した後、0.94 LR を報告しています。 サンプルの吸光度や実験設定の違いがなければ、この研究の UV 線量を計算することはできませんが、これらの結果は SARS-CoV-2 の UV222 に対する高度な感受性を示しており、我々の結果と概ね一致しています。

文献と照らし合わせて私たちのデータを考慮すると、UV222 は水溶液中の SARS-CoV-2 に対する有望な消毒方法です。 これらの感染力と分子量反応データは、感染性 SARS-CoV-2 やその他のウイルスが数日間持続する可能性があることが示されている場所で、水や廃水による感染の可能性を防ぐための対策を即座に提供できる可能性があります 37,38,39。 分子アッセイの用量反応でテーリングが観察され、タンパク質を含む増殖培地中でのウイルスの凝集が一因である可能性があるが、プラークアッセイではウイルスが検出されるレベル以下で消毒され、凝集がウイルスの完全な不活化を妨げなかったことを示している。 N遺伝子損傷の動態（短いアンプリコンと長いアンプリコンを使用したqPCRによって測定）と消毒の間に強い関係は観察されませんでした。これは、SARS-CoV-2のゲノム損傷よりもタンパク質損傷の方が消毒に寄与していることを反映している可能性があります。 MS2 バクテリオファージに関するある研究では、RNA ゲノム損傷が消毒動態に密接に関連しており、消毒動態に寄与していることが判明しました 15 が、アデノウイルスに関する研究では、DNA ゲノム損傷が消毒と密接に関連していないことが判明しました 40。 異なる構造を持つこれらのウイルスと宿主の間の相違は、タンパク質損傷、特に外部カプシドタンパク質への損傷がアデノウイルスの UV 消毒により強く寄与することが示されたときにさらに実証されました 41。 しかし、N タンパク質の損傷と消毒の動態との間に強い関連性も見られませんでした。 ウイルスゲノムと密接に関連するNタンパク質のみを測定したため、表面に存在して入射紫外線を吸収し、宿主細胞の感染に不可欠なスパイクタンパク質などの外部タンパク質への損傷を見逃していた可能性があります42。 この研究の実施時には、利用可能なアッセイが限られていたため、スパイクタンパク質に対する UV222 の影響を理解することはできませんでしたが、スパイクタンパク質の変異を伴う SARS-CoV-2 変異体が引き続き出現するため、今後も重要であり続けるでしょう。 さらに、ゲノムとタンパク質の確認と配列は、UV 遺伝子損傷に影響を与える可能性があるため 43、44、45、46、47、そのため、N タンパク質と遺伝子は主に消毒を誘発する分子損傷に寄与する標的ではない可能性があります。 これらの要因は、我々が観察した消毒動態と N 遺伝子損傷または N タンパク質損傷との弱い関係を説明できる可能性があり、この UV 波長および他の UV 波長での消毒のメカニズムを解明するためのさらなる研究が必要となるでしょう。 これらの機構の複雑さはまだ解決されていないが、我々が報告する消毒動態は、水溶液中のSARS-CoV-2がUV222に対して高度に感受性が高いことを示している。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、オハイオ州立大学 (OSU) 持続可能性研究所からの資金によって支援されました。 OSU感染症研究所; OSU土木・環境・測地工学部（部長：アリソン・マッケイ博士）。 OSU微生物感染・免疫部門（議長：ユージン・オルツ博士）。 および国立衛生研究所 (U54 CA260582)。 AquiSense Technologies の Anna Herman 氏は、SARS-CoV-2 の UV 消毒研究への参考文献のリストを共有しました。 UV222 光源 (USHIO Care222®) は、材料移転契約 2020-2654 を通じて USHIO, Inc. から OSU のハルに提供されました。

オハイオ州立大学、微生物感染免疫学部、米国オハイオ州コロンバス

リチャード・T・ロビンソン、ナジムス・マフフーズ、オスカー・ロサス＝メヒア

オハイオ州立大学感染症研究所、米国オハイオ州コロンバス

リチャード・T・ロビンソン

オハイオ州立大学土木環境測地工学部、2070 Neil Ave、Hitchcock 417C、Columbus、OH、43210、USA

Yijing Liu & ナタリー M. ハル

オハイオ州立大学サステナビリティ研究所、米国オハイオ州コロンバス

ナタリー・M・ハル

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RTR と NMH は研究を計画し、資金とリソースを獲得しました。 すべての著者がデータの収集/分析と図の作成に貢献しました。 RTR と NMH が原稿を起草しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

ナタリー・M・ハルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ロビンソン、RT、マフフーズ、N.、ローザス・メヒア、O. 他溶液中の SARS-CoV-2 の UV222 消毒。 Sci Rep 12、14545 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18385-4

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受信日: 2021 年 3 月 10 日

受理日: 2022 年 8 月 10 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18385-4

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